PCR Tempo Real e Digital

PCR\r\nA técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) é um método semiquantitativo rápido que possibilita a amplificação in vitro de fragmentos específicos de DNA, partindo-se de uma quantidade mínima de DNA-alvo ou de RNA previamente convertido em cDNA, a fim de obter material suficiente para as diversas análises.\r\nA PCR convencional é baseada na amplificação das sequências alvo seguidas por eletroforese em gel de agarose para visualização dos fragmentos de DNA amplificados e eventualmente sua posterior clonagem. Modelos que executem a ciclagem utilizando gradientes de temperatura permitem otimização de metodologia. \r\nEssa metodologia possui a desvantagem de permitir a detecção dos produtos de reação apenas no final de todos os ciclos de termociclagem.\r\nPCR Tempo real\r\nA técnica de PCR em tempo real gera dados qualitativos e quantitativos. Permite a detecção e amplificação simultaneamente, ciclo a ciclo, com elevada sensibilidade e especificidade da intensidade de fluorescência emitida em decorrência da amplificação da sequência de DNA-¬alvo. O resultado é visualizado em tempo real, gerando dados quantitativos com maior precisão. Isso possibilita a análise comparativa da expressão do gene de interesse entre as amostras logo no início da fase exponencial de amplificação, em que não há saturação da amplificação, eliminando um viés da PCR convencional.\r\nÉ importante observar que a eficiência das reações de amplificação depende de diversos fatores, como o cuidado nas pipetagens, a qualidade e integridade das amostras (molde de RNA e cDNA), desenho dos primers, condições de termociclagem (temperatura de desnaturação e de anelamento dos primers), qualidade e quantidade dos reagentes e também o tamanho do produto a ser amplificado. Condições específicas para cada experimento devem ser padronizadas. \r\nA técnica é utilizada para detecção de patógenos ou células/sequências específicas em misturas complexas, ou para analisar expressão gênica de um único alvo ou um painel (multiplex).

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